注冊
您所在的位置 >  首頁 >  新聞專區 > 教您如何正確選擇顯微鏡相機的分辨率【譯自:MicroscopyU】

教您如何正確選擇顯微鏡相機的分辨率【譯自:MicroscopyU】

一個電荷耦合裝置(俗稱CCD)或互補性氧化金屬半導體(俗稱CMOS)的成像芯片的最終分辨率取決于光電二極管的數量和它們相對于顯微鏡光學系統投射到成像陣列表面上圖像尺寸的函數所決定。當嘗試將顯微鏡的光學分辨率匹配到特定的數碼相機和視頻耦合器的組合時,使用該計算器可確定所需的最低像素密度,以充分捕獲來自顯微鏡的所有光學數據。

 

微信圖片_20200416111344.jpg


該教程以隨機選擇的標本初始化,顯示在“Specimen Image”窗口(黑框)中,并以目鏡的孔徑或投射聚光鏡的視場光闌為界。指定CCD尺寸(默認2/3英寸)的彩色矩形疊加在圖像上,以顯示成像芯片所捕獲樣品的實際區域。在樣本圖片左側灰色、黃色和紅色的方框中,圖像的顯微鏡光學分辨率(灰色)、CCD所需像素尺寸(黃色)、最佳CCD陣列尺寸(黃色)、顯示器的放大倍率(紅色)和總放大倍率(紅色)以微米或乘積顯示,這些數值會隨著下方滑塊的拖動而持續更新。通過樣本圖片下方的單選按鈕,可以選擇新的CCD格式(尺寸)。所選傳感器的物理CCD尺寸(以毫米為單位)沿著與成像芯片具有相同長寬比的矩形一起顯示在樣本圖片的右側。

 

操作該教程,請移動數值孔徑(Numerical Aperture)和物鏡放大倍率(Objective Magnification)滑塊,以為需要考慮的顯微鏡光學配置設置適當的數值。接著,選擇一個目鏡或投射聚光鏡的視野數(從18~26毫米)和視頻耦合器(中繼鏡)的放大倍率(從0.5x~1.0x之間)。耦合器滑塊被移動時,疊加在樣本圖片上的矩形的大小隨之改變,以匹配CCD傳感器所捕獲的樣本區域。可以用“Choose a Specimen”下拉菜單隨時選擇一個新的標本。

 

將光學顯微鏡產生的圖像捕獲至CCD或CMOS圖像傳感器上的光電二極管陣列的效率取決于多個因素,從物鏡放大倍率、數值孔徑和分辨率、電子圖像傳感器光電二極管陣列的尺寸、長寬比、攝像中繼鏡倍率,以及陣列中各個光感元件的尺寸。此外,還必須考慮用于成像的特定樣本的參數,例如對比度、信噪比、場景內動態范圍和積分時間。

 

CCD最終的光學分辨率取決于光電二極管的數量和它們相對于顯微鏡光學透鏡系統投射到成像陣列表面上圖像尺寸的函數所決定,當前可用的CCD陣列隨著尺寸的變化,從幾百至數千像素。用于科研設備中的現代陣列尺寸范圍從1000×1000到5000×5000個傳感器元件。消費級和科學級CCD的發展趨勢是傳感器尺寸持續減小,目前,具有小至4×4微米光電二極管的數碼相機已經面市。

 

只有為每個可分辨單元制作至少兩個樣本,才能實現用顯微鏡的光學元件對樣品成像的足夠的分辨率,盡管許多研究人員更愿意為每個可分辨單元提供三個樣本以確保足夠的采樣。在諸如顯微鏡這一類受限于衍射的光學儀器中,當使用數值孔徑為1.4的物鏡時,在平均可見光波長(550納米)處的光學分辨率的阿貝極限為0.2微米。在這種情況下,首選7×7微米的傳感器尺寸,10平方微米的傳感器尺寸剛好足夠大,以讓光學和電子分辨率進行匹配。盡管CCD成像傳感器中更小的光電二極管可以提高空間分辨率,但同時它們也限制了設備的動態范圍。

 微信圖片_20200416111414.jpg



表一:匹配顯微鏡光學分辨率所需的像素尺寸


 

在用顯微鏡觀察時,圖像通常由光學系統投影到探測器表面,該探測器可以是人眼的視網膜、電圖像傳感器或者傳統膠片上的光敏化學乳劑。為了優化所得到的圖像的信息內容,探測器的分辨率必須與顯微鏡的分辨率緊密匹配。用于生成樣品圖像的可見光波長光譜是決定顯微鏡光學分辨率性能的決定性因素之一。與較長的波長(大于500納米)相比,較短的波長(375~500納米)能更大限度的解析細節。空間分辨率的極限還取決于通過光學系統的光的衍射,該術語通常稱為衍射極限分辨率。研究人員推導出了幾個方程,這些方程被用來表達數值孔徑、波長和光學分辨率之間的關系:

微信圖片_20200416111521.png

 


其中 r 是分辨率(兩個樣本點之間的最小可分辨距離),NA 等于物鏡的數值孔徑,λ 等于波長,NA(Obj)等于物鏡的數值孔徑,NA(Cond)是聚光鏡的數值孔徑。注意公式(1)和(2)的乘積因子不同,公式(1)為0.5,公式(2)則為0.61。這些方程式基于多種因素,包括光學物理學家為解決物鏡和聚光鏡的特性而進行的各種理論計算,不應視為任何一般物理定律的絕對值。假設當兩個點光源中的其中一個所產生的Airy斑,與第二個Airy斑的衍射圖像的一階反射重疊時,這兩個點光源可以被解析(分別成像)的條件被稱為瑞利標準。在某些情況下,例如共聚焦、多光子熒光顯微成像,分辨率實際上可能超過了這三個方程式中任何一個所設定的極限。其他因素(比如:較低的樣本對比度,不正確的照明等)可能會降低分辨率,并且現實中 r 的最大值(使用中光譜波長550納米時大約為0.20微米)和1.35~1.40的數值孔徑往往很難實現。

 

當顯微鏡完美對中,并且物鏡與載物臺下的聚光鏡匹配恰當時,可以將數值孔徑的值代入方程式(1)和(2),結合額外的結果方程式(3)簡化為方程式(2)。要注意的一個重要概念,放大倍率并沒有作為一個因子出現在這些方程式中,因為只有數值孔徑和照明光的波長決定了樣品的分辨率。如上所述(也可以從方程式中觀察到),照明光的波長是顯微鏡分辨率的重要因素。波長越短,分辨率越高( r 的值越小),反之亦然。光學顯微鏡中最高的解析能力是由近紫外光實現的,這是最短的有效成像的波長。在可以解析樣品的細節的能力上,近紫外光之后是藍色,然后是綠色,最后是紅色。在大多數情況下,顯微鏡用戶使用鎢鹵素燈泡產生的廣譜白光進行樣品的照明。可見光譜的中心位于大約550納米,這是綠光主要的波長(我們眼睛對綠光最為敏感)。該波長在本教程和表1中被用來計算分辨率值,數值孔徑值在這些方程式中同樣重要,更高的數值孔徑可以獲得更高的分辨率(見表1)。

 

撰稿人:

Matthew J. Parry-Hill, Kimberly M. Vogt, John D. Griffin, and Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.



電   話: 010-62553066
010-62565779(總機)

傳   真: 010-62566652

測量部:400-172-5117

測定部:400-820-5501

上海天天彩四